色谱既是一门科学，也是一门艺术。在合成反应产物和天然产物之间，需要分离、纯化和分离的化合物范围广泛且多样，不时带来挑战。由于这种多样性，并不是所有的色谱分离都可以用“中性”溶剂系统进行——一个不添加pH调节剂或缓冲液的系统。
您可能不知道反应产物或副产物的pKa，那么您如何知道何时在流动相中加入酸？根据您的反应，如果需要分离可电离/离子化合物或固有酸性/碱性化合物，则流动相改进剂可能非常有用。在这篇文章中，我展示了一些降低流动相pH值可以改善峰形状或提高分离选择性的例子。
低pKa化合物
纯化低pKa的化合物时，zui好酸化流动相，以尽量减少或消除化合物电离。一个很好的经验法则是将流动相的 pH 值降低 2 个单位，低于目标化合物的 pKa。对于反相，这可以通过向每种溶剂中添加甲酸、乙酸或三氟乙酸来实现，或者创建第三种酸化溶剂，如果您的闪蒸系统具有该能力，则可以等比例混合。等度法是我在以下示例中使用的方法，1）使用Biotage®Selekt系统分离马尿酸（pKa 3.6）和靛酸酐，2）使用Biotage®Isola Dalton 2000纯化酰胺反应产物。
对于实施例1，在中性条件下，我们看到马尿酸峰的主要前沿和扭曲的靛酸酐峰，图1。发生这些现象的原因是化合物，尤其是马尿酸，在溶液中部分解离，既作为完整化合物存在，也作为电离化合物存在。与母体化合物相比，电离形式更具极性，保留更少，因此想要更早地洗脱，从而产生马尿酸和不对称形状的马尿酸。
图1.马尿酸和靛酸酐的中性pH溶剂分离。
为了消除这些问题，我在梯度中添加了酸性改性剂溶剂（1% TFA 水溶液），浓度为总溶剂组成的10%，形成了0.1%的TFA改性流动相。添加的酸将两种化合物质子化为其天然形式，使洗脱带锐化，并略微增加保留（由于疏水性增加），图2。
图2.流动相酸化的结果是两个峰的锐化。
选择性改进
反相方法开发的一个关键方面是zui大化选择性，即相邻洗脱化合物之间的分离程度。有时，只需将有机溶剂从乙腈改为甲醇或将甲醇改为乙腈，即可改变选择性。然而，在其他情况下，向流动相中添加酸会改变产物、副产物或可能所有化合物的电离，从而影响色谱选择性。
我们可以通过实例2看到这一点，即琥珀酸与α-甲基苄胺的反应产物。使用中性pH值，产物（+m/z 221.8）和副产物（+m/z 342.8）共洗脱，图3。
图3.用pH中性流动相纯化酰胺反应混合物。产物+m/z 221.8具有表明类似疏水性的共洗脱副产物（+m/z 342.8）。
然而，通过以等比例引入0.1%乙酸作为第三种溶剂，较高分子量的副产物被电离，迫使其比合成产物更早洗脱，同时产物保留也增加，进一步提高了纯化效率，见图4。
图4.酸化流动相质子化产物及其共洗脱副产物，提高纯化效率。
那么，是什么原因导致这两种化合物相对彼此转移了保留率呢？通过降低流动相的pH值，一个质子被加入到流动相中，这将导致任何pKa高于流动相pH值的化合物电离。电离化合物比中性化合物更具极性，对疏水固定相的亲和力更小，在极性流动相中的溶解度更大。同样，pKa等于或低于流动相的化合物将质子化，从而增加其疏水性和在反相柱上的保留。
