对于所有形式的色谱法，都存在与样品负载相关的限制——质量和体积。这些是自变量，为了获得zui佳结果，应单独调查。在这篇文章中，我将讨论增加溶剂体积对快速色谱分离的影响。
确定zui大加载体积的一个相关且关键的变量是溶解溶剂（样品溶剂）的选择。如果溶剂强度太高，则会导致峰变宽，并zui终导致产品损失，因为某些样品会以 1 CV 与样品溶剂一起洗脱。
正如之前的帖子中提到的，在可能的情况下，zui大限度地提高样品浓度溶解溶剂中 ，以zui大限度地提高分离性能。
为了帮助说明溶解溶剂和进样体积的作用，我将展示溶解在两种不同溶剂，甲醇 (MeOH) 和二甲亚砜 (DMSO) 中的反应混合物的纯化数据。
马尿酸 (~0.5 g) 和 α-甲基苄胺 (~0.4 g) 在乙酸乙酯 (EtOAc) 中在 200 °C 下反应 10 分钟，使用 Biotage Initiator+ 微波合成仪进行两次。合成后，我将每个反应转移到自己的 20 mL 闪烁瓶中，并使用 Biotage V-10 Touch 蒸发掉 EtOAc。
反应1产生932.5毫克，而反应2产生的总质量为 942.5 毫克。将反应1溶解在 MeOH 中至体积为5mL，而将反应2溶解在相同总体积的 DMSO 中。选择这些溶剂是因为它们提供了完全的反应混合物溶解度。
在本研究中，我在Biotage Isolera Dalton 2000 上使用了 12 克 Biotage Sfar C18 色谱柱。12 克C18 色谱柱的柱体积 (CV) 为 17 mL。注射量需要根据CV的百分比来考虑，并应保持尽可能小。我选择道尔顿2000系统是因为它能够确定是否有任何反应混合物组分与溶解溶剂一起洗脱，这是体积过载的明显迹象。
第1个测试使用了一个小的0.1mL上样量 (~18.75 mg)，相当于色谱柱体积的0.6%。使用这个小体积，两个样品提供了相同的色谱，图 1。 
图 1. 上样量为 0.1 mL (0.6% CV) 的反应混合物纯化溶解溶剂的色谱比较。顶部 - MeOH 溶解的反应混合物。底部 - DMSO 溶解的反应混合物。
测试二将进样体积增加到0.5mL (~93.75 mg)，等于色谱柱体积的 2.9%。在这里，我们可以看到甲醇样品的峰开始变宽，但仍能提供出色的分离效果，图 2。 
图 2. 上样量为0.5mL (2.9%) 的反应混合物纯化的比较。顶部 - MeOH 溶剂化反应混合物。底部 - DMSO 溶剂化反应混合物。
在zui后一次测试中，进样量加倍至1mL (~187.5 mg)。在此体积下，即色谱柱体积的 5.9%，甲醇样品显示出较大的分离度损失，这是由于较宽的峰以及在溶剂前沿洗脱的产物。然而，DMSO 样品仍然产生了出色的分离效果，没有产物与 DMSO 峰一起洗脱，并且有进一步增加负载的空间，图 3。 
图3. 1mL上样体积（CV 的 5.9%）的色谱比较。顶部 - MeOH 溶剂化反应混合物，其中可以看到样品穿透以及峰变宽和分辨率损失。底部 - DMSO 溶剂化反应混合物显示没有突破和完全分辨率。
如您所见，样品溶剂的选择对纯化质量有重大影响。虽然甲醇的极性相当大 ( log P -0.77 )，但它是梯度中的强溶剂，限制了其加载体积范围。另一方面，DMSO 极性很强（ log P -2.03 )并且是一种非常好的溶剂，DMF 也是一种极好的溶解溶剂选择。 DMSO 广泛的溶剂化特性和非常高的极性使其成为我想要zui大限度地提高负载和纯化通量时的反相溶解溶剂的选择。
如果您使用甲醇，甚至乙腈作为样品溶剂，请将体积保持在色谱柱体积的 3% 以下。如果您将样品溶解在 DMSO 中，您可以合理地期望在保持分离的同时至少将进样体积和质量负载增加一倍。
