ODS柱的冲洗方法

ODS色谱柱填充有十八烷基甲硅烷基（ODS基团或C18基团）与硅胶载体化学键合。ODS柱用于反相色谱。ODS 色谱柱因其高理论塔板数和快速平衡而具有广泛的应用。它们的低成本使其成为HPLC中使用zui广泛的色谱柱。

然而，在使用这些色谱柱时可能会出现各种问题。下面介绍典型的原因和症状。随后的解释涵盖了去除吸附成分的冲洗方法。

ODS色谱柱的典型问题

* 这些是主要原因和症状。可能存在其他问题。

(1) ODS柱填料表面（固定相）

在考虑冲洗方法时，重要的是要考虑作用在组件上的吸附力。 首先，我们将回顾我们对 ODS 填料表面的了解。

羟基zui初以 Si-OH 结构附着在硅胶载体的表面。 这被称为“硅烷醇”。 ODS 填料是通过化学反应将 ODS 基团与硅烷醇键合形成的。 但是，由于 ODS 基团体积庞大且反应性不高，因此会残留大量未反应的硅烷醇。

由于这种残留的硅烷醇会在分析过程中产生各种不利影响*，因此硅烷醇会因与三 甲基甲硅烷基 (TMS) 基团的反应而受到限制，而三 甲基甲硅烷基 (TMS) 基团并不庞大（反应性高）。 该操作称为“封端”、“三 甲基甲硅烷基化”或“二级甲硅烷基化”。 然而，少量的硅烷醇仍会保留在表面上，在分析过程中，ODS 基团可能会逐渐去除以在 ODS 柱中产生硅烷醇。

*相反，一些商业 ODS 柱包含一定量的硅烷醇，因为某些分析方法利用了硅烷醇的吸附作用。

(2) 冲洗掉因疏水相互作用而残留的成分

术语“疏水相互作用”表示具有低极性的组分区域和具有低极性的 ODS 基团之间的亲和力。 它是真正的反相色谱使用的保留力。 低极性区域包括烷基和芳环。 在右图的顶部，组件的丙基被吸引到 ODS 基团上。 低极性流动相用于冲洗被这种力保留的组分。 如果使用 1/1 的甲醇/水作为分析的流动相，例如，将甲醇比率增加到 3/1，会降低冲洗液的极性，并且更容易冲洗掉具有高保留力的组分。在列中。 更换流动相时必须考虑兼容性。 如果在上面的例子中使用缓冲溶液代替水，如果有机溶剂比例突然增加，盐可能会沉淀出来。 如果使用缓冲溶液/有机溶剂混合物作为流动相进行分析，则在增加有机溶剂比率之前，必须先用相同比率的水/有机溶剂混合物*冲洗色谱柱和流路。 在冲洗过程中，用检测器进行监测以确定基线是否稳定。

• 在用作冲洗液的流动相中加入少量酸通常是有益的。 这在下面的(3)中描述。 如果使用 100% 甲醇作为流动相，请使用极性较低的冲洗液，例如四氢呋喃 (THF)。

(3) 冲洗掉通过氢键或离子键吸附的成分

如上文 (1) 所述，少量硅烷醇残留在填料表面。 硅烷醇中的氢将电子吸引到氧上以产生有点正的静电荷。 因此，氢具有与元件中氮上的孤对（带负静电荷）形成氢键的特性。 （右上方图表的中间一行）在弱酸性或中性流动相中，这种氢键会吸附碱性成分并导致拖尾。 （硅烷醇在较高的 pH 值下形成离子键。）强吸附的碱性成分不能被有机溶剂冲洗掉。 在这种情况下，必须使用酸性冲洗溶液通过将氢离子与氮上的孤对电子配位（质子化）来限制氢键。 R-NH 2 → R-NH 3 + 加入大约 0.1% 的磷酸或醋酸制成酸性冲洗液。

一般认为，强烈保留在柱内的成分包括这样的基本成分。 这是添加酸有利于上述(2)中的漂洗的原因。 如果碱性组分残留在色谱柱中（包括使用碱性化合物作为离子对试剂时），请勿用水冲洗。 用水冲洗会增加吸附组分周围的 pH 值，使硅胶易于溶解。 添加酸有助于避免这个问题。

然而，一些组分很难通过简单地使流动相呈酸性来去除。 这是具有大离子半径的阳离子的情况，例如四丁基铵。

在这种情况下，离子键被认为是与解离的硅烷醇的负电荷一起发生的。 （图表顶部） 随着离子半径的增加，离子键变得更强。 下图显示了在酸性条件下末端氨基带正电的情况。 由于电荷密度高，会发生多层次的水合作用，这使得阴离子难以接近。 然而，由于被庞大烷基团包围的铵离子的水合作用很弱，阴离子可以更容易接近。

参考：在离子交换色谱过程中，离子洗脱从离子半径小的离子开始：F - 、Cl - 和 Br - 。 这表明离子键随着离子半径的增加而变得更强。

要削弱离子键，请使用含有大半径阴离子* 作为离子对的酸性冲洗液。 酸性会抑制硅烷醇的解离。 * 例如，添加大约 0.1 M 高氯酸钠。 高氯酸钠虽然是无机盐，但具有溶于100%甲醇或乙腈不易沉淀的特性。 由于高氯酸根离子在流动相中容易形成离子对，因此也可用于离子对色谱。 （但是，这是一种危险的试剂。不要加热它或将它放在明火附近。将废液稀释到中性状态，并通过有执照的废物处理承包商进行处理。）

补充

当硅烷醇解离时，它带有负电荷。当与金属离子结合时，它促进了配位化合物和酸性化合物的吸附。 为了冲洗掉金属离子，将竞争性离子物质或金属掩蔽剂添加到冲洗溶液中。 此外，由于需要限制硅烷醇的解离，因此降低流动相/冲洗溶液的 pH 值是有效的。

此外，使溶液呈酸性会削弱配位化合物的配位并限制酸性化合物中羧基的解离。 但是，由于硅胶在pH值4左右较为稳定，因此禁止长时间使用极酸性的溶液。 理想情况下，使用少量磷酸或乙酸。

(4) 总结

我们在上面描述了使用有机溶剂/缓冲溶液混合物作为分析流动相的常见程序是：1) 用相同混合比例的有机溶剂/酸水混合物冲洗，2) 使用酸性冲洗液冲洗增加有机溶剂的比例，3) 如果预计会包含强碱性化合物，请在冲洗液中加入高氯酸钠。

但是，每次分析的zui佳冲洗方法都不同。 在确定冲洗方法时，请始终牢记样品所含的成分以及使用的流动相。 即使 ODS 柱使用相同的硅胶载体，使用限制也可能不同。 仔细阅读使用说明书。